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一種宮頸癌相關基因甲基化檢測方法與流程

文檔序號:29648526發布日期:2022-04-13 22:03來源:國知局

1.本發明涉及基因檢測技術領域,具體為一種宮頸癌相關基因甲基化檢測方法。


背景技術:

2.高危型人類乳頭瘤病毒的持續性感染是宮頸癌的病因,但宮頸上皮的癌變過程還包括許多基因和表觀基因的改變,dna甲基化是最常見的表觀遺傳改變,常發生于腫瘤抑制基因的啟動子區域,造成該基因的轉錄失活,從而促使腫瘤的發生,現有文獻報道的宮頸癌中可檢測到dna甲基化,且可見于30%~80%的宮頸癌前期病變中,已有研究表明,檢測宮頸脫落細胞中特定基因的甲基化可能作為潛在的分子標志物用于宮頸癌的早期檢測。
3.目前采用的宮頸癌常規篩查技術著存在操作繁瑣、準確性低及敏感性不高的缺點,限制了其在臨床實驗室的廣泛應用。
4.綜上所述,本發明提供一種宮頸癌相關基因甲基化檢測方法來解決上述問題。


技術實現要素:

5.本發明的目的在于提供一種宮頸癌相關基因甲基化檢測方法,以解決上述背景技術中提出的問題。
6.為實現上述目的,本發明提供如下技術方案:
7.一種宮頸癌相關基因甲基化檢測方法,包括以下步驟:
8.s1,對宮頸細胞樣本進行提取處理得到細胞dna樣本,接著對細胞dna樣本進行重亞硫酸鹽快速轉化,得到轉化產物;
9.s2,對轉化產物進行酶切處理,得到酶切產物,再對得到的酶切產物進行pcr擴增,得到pcr擴增引物組;
10.s3,對pcr擴增引物組進行實時熒光定量pcr檢測,并計算出甲基化程度。
11.作為本發明優選的方案,所述s1中提取處理的具體操作步驟為:
12.s11,將宮頸細胞樣本送入離心機中進行離心處理,處理結束后移除上清液,得到樣本沉淀物;
13.s12,將樣本沉淀物、蛋白酶k和裂解液abl混合,混合均勻后進行孵育,得到樣本dna,孵育的時間為45min-50min,所述孵育的溫度為55℃-58℃。
14.作為本發明優選的方案,所述s1中重亞硫酸鹽快速轉化的具體操作步驟為:
15.s21,將nahso3和(nh4)2so3
·
h2o溶于6.5ml(nh4)hso3溶液中,加熱至90℃至完全溶解,冷卻至室溫,檢測溶液的ph應在5.4

5.5,得到轉化液;
16.s22,將細胞dna樣本加入55ul轉化液中,在85℃下處理15min,冷卻至室溫,得到轉化產物。
17.作為本發明優選的方案,所述s2中酶切處理使用的是限制性內切酶反應液,且限制性內切酶反應液由限制性內切酶和限制性內切酶酶切緩沖液混合制成。
18.作為本發明優選的方案,所述pcr擴增引物組包括目標基因引物組、目標基因引物
組的上游引物以及目標基因引物組的下游引物。
19.作為本發明優選的方案,所述s3的具體操作步驟為:
20.s31,以dttp、dgtp、datp以及第三標記物作為底物,將pcr擴增產物組加入到固定有親和素受體的酶標板中,使pcr擴增產物通過第三標記物與親和素受體的作用固定到酶標板上;
21.s32,使用第一熒光標記物標記目標基因引物組的上游引物,用第二熒光標記物標記目標基因引物組的下游引物,用酶標儀測量第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度,第一熒光標記物的信號強度為m,第二熒光標記物的信號強度為n;
22.s33,計算出n/m的數值,即為宮頸細胞樣品中基因甲基化程度。
23.作為本發明優選的方案,所述第一熒光標記物為fitc,第二熒光標記物為cy5,第三標記物為生物素。
24.作為本發明優選的方案,所述s11中離心機的離心時間為2.5min-3min,離心轉速為16000rpm-17000rpm。
25.作為本發明優選的方案,所述s12中宮頸脫落細胞樣本、蛋白酶k和裂解液abl的體積比為70:1:10。
26.作為本發明優選的方案,所述s21中nahso3與(nh4)2so3
·
h2o的質量比為3比1,(nh4)hso3的濃度為50%。
27.與現有技術相比,本發明的有益效果是:
28.1、本發明中,通過對宮頸細胞樣本進行提取處理得到細胞dna樣本,接著對細胞dna樣本進行重亞硫酸鹽快速轉化,得到轉化產物,再對轉化產物進行酶切處理,得到酶切產物,將得到的酶切產物進行pcr擴增,得到pcr擴增引物組,對pcr擴增引物組進行實時熒光定量pcr檢測,并計算出甲基化程度,在檢測過程中無需設計特異性探針或特異性引物,方法簡便易行,所采用的技術簡單易于實現,成本低,操作較為簡單快捷,準確性較高,敏感性強的缺點,能夠在臨床上廣泛使用,同時通過實時熒光定量pcr檢測計算出基因的甲基化程度,使檢測人員在一定程度上能夠對基因的甲基化程度進行定量分析,進一步提高的檢測的準確性。
具體實施方式
29.下面將結合本發明實施例,對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例,基于本發明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明保護的范圍。
30.除非另有定義,本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同,本文中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的,不是旨在于限制本發明,本文所使用的術語“及/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。
31.本發明提供一種技術方案:
32.一種宮頸癌相關基因甲基化檢測方法,包括以下步驟:
33.s1,對宮頸細胞樣本進行提取處理得到細胞dna樣本,接著對細胞dna樣本進行重
亞硫酸鹽快速轉化,得到轉化產物;
34.s2,對轉化產物進行酶切處理,得到酶切產物,再對得到的酶切產物進行pcr擴增,得到pcr擴增引物組;
35.s3,對pcr擴增引物組進行實時熒光定量pcr檢測,并計算出甲基化程度。
36.進一步的,所述s1中提取處理的具體操作步驟為:
37.s11,將宮頸細胞樣本送入離心機中進行離心處理,處理結束后移除上清液,得到樣本沉淀物;
38.s12,將樣本沉淀物、蛋白酶k和裂解液abl混合,混合均勻后進行孵育,得到樣本dna,孵育的時間為45min-50min,所述孵育的溫度為55℃-58℃。
39.進一步的,所述s1中重亞硫酸鹽快速轉化的具體操作步驟為:
40.s21,將nahso3和(nh4)2so3
·
h2o溶于6.5ml(nh4)hso3溶液中,加熱至90℃至完全溶解,冷卻至室溫,檢測溶液的ph應在5.4

5.5,得到轉化液;
41.s22,將細胞dna樣本加入55ul轉化液中,在85℃下處理15min,冷卻至室溫,得到轉化產物。
42.進一步的,所述s2中酶切處理使用的是限制性內切酶反應液,且限制性內切酶反應液由限制性內切酶和限制性內切酶酶切緩沖液混合制成。
43.進一步的,所述pcr擴增引物組包括目標基因引物組、目標基因引物組的上游引物以及目標基因引物組的下游引物。
44.進一步的,所述s3的具體操作步驟為:
45.s31,以dttp、dgtp、datp以及第三標記物作為底物,將pcr擴增產物組加入到固定有親和素受體的酶標板中,使pcr擴增產物通過第三標記物與親和素受體的作用固定到酶標板上;
46.s32,使用第一熒光標記物標記目標基因引物組的上游引物,用第二熒光標記物標記目標基因引物組的下游引物,用酶標儀測量第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度,第一熒光標記物的信號強度為m,第二熒光標記物的信號強度為n;
47.s33,計算出n/m的數值,即為宮頸細胞樣品中基因甲基化程度。
48.進一步的,所述第一熒光標記物為fitc,第二熒光標記物為cy5,第三標記物為生物素。
49.進一步的,所述s11中離心機的離心時間為2.5min-3min,離心轉速為16000rpm-17000rpm。
50.進一步的,所述s12中宮頸脫落細胞樣本、蛋白酶k和裂解液abl的體積比為70:1:10。
51.進一步的,所述s21中nahso3與(nh4)2so3
·
h2o的質量比為3比1,(nh4)hso3的濃度為50%。
52.具體實施案例:
53.先將宮頸細胞樣本送入離心機中進行離心處理,離心機的離心時間為3min,離心轉速為17000rpm,處理結束后移除上清液,得到樣本沉淀物,將樣本沉淀物、蛋白酶k和裂解液abl混合,宮頸脫落細胞樣本、蛋白酶k和裂解液abl的體積比為70:1:10,混合均勻后進行孵育,得到樣本dna,孵育的時間為50min,孵育的溫度為58℃,接著將nahso3和(nh4)2so3
·
h2o溶于6.5ml(nh4)hso3溶液中,nahso3與(nh4)2so3
·
h2o的質量比為3比1,(nh4)hso3的濃度為50%,加熱至90℃至完全溶解,冷卻至室溫,檢測溶液的ph應在5.4,得到轉化液,將細胞dna樣本加入55ul轉化液中,在85℃下處理15min,冷卻至室溫,得到轉化產物;
54.對轉化產物進行酶切處理,得到酶切產物,酶切處理使用的是限制性內切酶反應液,且限制性內切酶反應液由限制性內切酶和限制性內切酶酶切緩沖液混合制成,再對得到的酶切產物進行pcr擴增,得到pcr擴增引物組,pcr擴增引物組包括目標基因引物組、目標基因引物組的上游引物以及目標基因引物組的下游引物,以dttp、dgtp、datp以及第三標記物作為底物,將pcr擴增產物組加入到固定有親和素受體的酶標板中,使pcr擴增產物通過第三標記物與親和素受體的作用固定到酶標板上,使用第一熒光標記物標記目標基因引物組的上游引物,用第二熒光標記物標記目標基因引物組的下游引物,第一熒光標記物為fitc,第二熒光標記物為cy5,第三標記物為生物素,用酶標儀測量第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度,第一熒光標記物的信號強度為m,第二熒光標記物的信號強度為n,計算出n/m的數值,即為宮頸細胞樣品中基因甲基化程度。
55.盡管已經示出和描述了本發明的實施例,對于本領域的普通技術人員而言,可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。
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