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一種作用于高血壓血瘀癥的基因及其檢測引物的制作方法

文檔序號:29648224發布日期:2022-04-13 21:50來源:國知局
一種作用于高血壓血瘀癥的基因及其檢測引物的制作方法

1.本發明屬于生物領域,尤其涉及一種作用于高血壓血瘀癥的基因及其檢測引物。


背景技術:

2.高血壓病是動脈血壓持續偏高的慢性疾病,也是缺血性心臟病、腦血管損害和動脈硬化最主要的促危因素,是我國目前心腦血管并發癥最嚴重的疾病。近年研究表明高血壓患者中血瘀在整個疾病進展中起著重要的作用,高血壓患者中血瘀癥占比47%,高血壓病不同時期均可出現不同程度的血瘀癥候。
3.中醫認為凡是離經之血蓄留于體內或血行不暢蓄留于器官、臟腑、組織中,引起臟腑的功能失調,均屬于瘀血,因瘀血產生的一系列證候即為血瘀癥?,F代醫學研究表明,動脈狹窄、硬化及粥樣斑塊的形成,影響了血流,并且血漿粘度、全血粘度、紅細胞壓積升高,導致了心臟血液流變學的改變及微循環障礙,致使血液呈“粘、濃、凝、聚”狀態,這符合中醫所認識的“血瘀”表現。臨床研究發現,高血壓病血瘀癥患者存在相關因子如no、et-1、epcr、tm、vwf、tpa、pai等與血管舒張收縮、凝血抗凝以及相關炎癥因子指標的異常改變。
4.內質網(endoplasmic reticulum,er)是在真核生物細胞中由膜圍成的隧道系統,也是真核細胞合成蛋白質、脂質和鈣存儲的重要細胞器,在調節蛋白質正確折疊、鈣穩態、內質網應激和細胞凋亡等方面發揮著重要作用。適度的內質網應激可通過迅速調節細胞內ca2+平衡、蛋白質折疊修飾和細胞凋亡,從而維持內環境的穩態,使細胞不斷適應環境的改變而發揮保護作用,但持續、過度的內質網應激會引起疾病的發生。已證實由ers引發的血管內皮細胞障礙參與了各種由血管損傷引起的病理生理過程及相關疾病,如高血壓、動脈粥樣硬化、腦卒中等。。


技術實現要素:

5.為解決上述問題,本發明提供了一種作用于高血壓血瘀癥的基因及其檢測引物。本發明發現atf4基因可以影響et-1、epcr、tm、vwf、pai、no和tpa的表達,從而對應調節動物的血壓血瘀情況。
6.為達到上述技術效果,本發明的技術方案是:
7.一種作用于高血壓血瘀癥的基因,所述基因為atf4基因。
8.進一步的改進,所述atf4基因為小鼠atf4基因或人atf4基因。
9.一種作用于高血壓血瘀癥的基因的檢測引物,所述檢測引物用于檢測atf4基因或atf4基因轉錄的mrna。
10.進一步的改進,所述檢測引物的正向序列為:5
’?
caaaacaagacagcagccacta-3’,所述檢測引物的反向序列為5
’?
cttcttcccccttgccttac-3’。
11.一種atf4基因的表達產物,所述表達產物用作提高動物體內et-1、epcr、tm、vwf或pai含量的藥物。
12.進一步的改進,所述表達產物用作降低動物體內no或tpa含量的藥物。
13.一種阻斷atf4基因表達的mrna序列,所述mrna序列用作降低動物體內et-1、epcr、tm、vwf或pai含量的藥物。
14.進一步的改進,所述mrna序列用作提高動物體內no或tpa含量的藥物。
15.進一步的改進,所述mrna序列為atf4基因翻譯的mrna序列的互補序列。
16.本發明優點:
17.本研究經高鹽誘導后構建高血壓血瘀癥小鼠模型,wt-hs組血壓明顯升高,ko-hs組血壓未明顯改變,說明敲除atf4基因可阻滯血壓升高;血瘀癥相關指標結果顯示:ko-hs組與wt-hs組相比,et-1、epcr、tm、vwf、pai顯著降低,no、tpa表達增加(p《0.05),et-1具有收縮血管的功能,pai能抑制溶血,epcr、tm、vwf作為血管內皮細胞損傷的特異性標志物,no具有強烈的舒張血管的功能,而tpa能高效溶解血栓。這些細胞因子的增加或減少都提示高鹽誘導的高血壓小鼠血管內皮功能障礙,而敲除atf4基因后,能明顯舒張血管,促進血液流通,改善血管內皮功能。結合血壓和血瘀癥相關因子的研究結果,表明敲除atf4基因能改善高血壓血瘀癥。
附圖說明
18.圖1為4周血壓測量值圖;
19.圖2各個時間點收縮壓測量值;
20.圖3為elisa的各檢測圖;
21.圖4為atf4蛋白測量免疫印跡圖;
22.圖5為atf4蛋白測量灰度值;
23.圖6為atf4的基因表達量(備注:ap《0.05vs wt-ns組,bp《0.05vs ko-ns組,cp《0.05vs ko-hs組;wt-ns:野生型+正常飲食組;wt-hs:野生型+8%高鹽飲食組;ko-ns:atf4
+/-+正常飲食組;ko-hs:atf4
+/-+8%高鹽飲食組)。
具體實施方式
24.以下通過具體實施方式并且結合附圖對本發明的技術方案作具體說明。
25.實施例1
26.1.實驗動物:atf4基因敲除c57bl/6j小鼠購于南京動物模式研究所,野生型c57bl/6j小鼠購于南方醫科大學動物中心,飼養于暨南大學實驗動物管理中心spf級屏障環境。
27.2.動物分組:atf4基因敲除c57bl/6j品系小鼠18只,野生型小鼠18只。分為基因敲除+正常飲食組(ko-ns:6只)、基因敲除+8%高鹽飲食組(ko-hs:12只)、野生型+正常飲食組(wt-ns:6只)、野生型+8%高鹽飲食組(wt-hs:12只)。
28.3.造模方法:wt-ns組及ko-ns組給予正常小鼠飼料喂養,wt-hs組及ko-hs組給予南通特洛菲公司定制的8%高鹽飼料喂養,期間自由飲食、自由飲水,共喂養28天;第29天取小鼠胸主動脈和小鼠血清做western blot和elisa檢測。
29.4.抗體:atf4 antibody(11815s)、gapdh loading control antibody(51332s)、goat anti-mouse igg antibody(14709s)。
30.5.實驗步驟:
31.一、血壓檢測
32.開始正式實驗前訓練小鼠3天,每天下午3點測量小鼠的血壓;當測量結果重復性很好,并且測量集合的收縮壓標準偏差很小時,開始正式實驗。采用blood pressure analysis程序開始測量鼠尾根部(距離鼠尾根部0.5cm左右)的血壓。在正式實驗前測量一次每組的血壓值,并在正式實驗后每隔4天測量一次血壓,共測量7次,整個周期為28天;正式實驗期間小鼠每天下午3點放置于在固定器10分鐘,且每步操作均由同一操作者完成。
33.1)imagej軟件分析結果如表1所示。
34.表1實驗小鼠的血壓記錄表
[0035][0036]ap《0.05vs wt-ns組,bp《0.05vs ko-ns組,cp《0.05vs ko-hs組;wt-ns:野生型+正常飲食組;wt-hs:野生型+8%高鹽飲食組;ko-ns:atf4
+/-+正常飲食組;ko-hs:atf4
+/-+8%高鹽飲食組。
[0037]
二、elisa檢測
[0038]
1)取小鼠血液,室溫血液自然凝固10-20min,2-8℃條件3000rpm離心20min,仔細收集上清,分裝后于-80℃保存;
[0039]
2)標準品的稀釋:按下表稀釋標準品制作標準曲線。
[0040][0041]
3)加樣:設置空白孔對照孔、待測樣品孔、標準孔。在酶標板上加入50μl標準品,待
測樣品孔中分別加入40μl樣品稀釋液以及10μl待測樣品,待測樣品最終稀釋5倍。加樣時盡量加在孔底部,避免觸及孔壁,加樣完成后輕輕搖勻。
[0042]
4)溫育:封板膜封酶標板后,設置37℃溫箱孵育30min。
[0043]
5)配液:超純水稀釋30倍濃縮洗滌液后備用。
[0044]
6)洗滌:輕輕揭去封板膜并棄去上樣液,每孔注滿稀釋后的洗滌液,靜置30s,棄去洗滌液,重復5次后拍干。
[0045]
6)加酶:待測樣品孔、標準孔中加入50μl酶標試劑。
[0046]
8)溫育:重復步驟4。
[0047]
9)洗滌:重復步驟6。
[0048]
10)顯色:每孔先加入50μl a顯色劑,之后再加入50μl b顯色劑,輕輕搖勻,避光孵育37℃15min.
[0049]
11)終止:每孔加入50μl終止液。
[0050]
12)測定:設置空白孔為基準值,450nm波長檢測每個孔的od值,在15min以內完成檢測。
[0051]
三.蛋白檢測
[0052]
1.1.1試劑配制
[0053]
1)10%過硫酸銨(aps)
[0054]
a)過硫酸銨
??
10g
[0055]
b)超純水
??
100ml
[0056]
2)30%聚丙烯酰胺
[0057]
a)丙烯酰胺
??
58g
[0058]
b)甲叉雙丙烯酰胺
??
2g
[0059]
c)蒸餾水定容至200ml
[0060]
3)10x電泳液
[0061]
a)tris
??
30.3g
[0062]
b)甘氨酸
??
187.7g
[0063]
c)sds 10g
[0064]
4)封閉液5%
[0065]
a)脫脂奶粉
??
5g
[0066]
b)tbst
??
100ml
[0067]
5)10x轉膜液
[0068]
a)tris
??
5.8g
[0069]
b)甘氨酸
??
2.9g
[0070]
c)sds 0.37g
[0071]
d)甲醇
??
200ml
[0072]
e)蒸餾水定容至1000ml,室溫保存6)1x轉膜液
[0073]
a)10x轉膜液 100ml
[0074]
b)無水乙醇
??
200ml
[0075]
c)蒸餾水
??
700ml
[0076]
7)10xtbs
[0077]
a)tris 2.42g
[0078]
b)nacl
??
8g
[0079]
c)蒸餾水定容至1000ml
[0080]
8)tbst緩沖液
[0081]
a)10xtbs緩沖液
??
100ml
[0082]
b)tween 20
??
1ml
[0083]
c)蒸餾水定容至1000ml,調節其ph為7.4-7.6
[0084]
1.1.2提蛋白
[0085]
1)取100mg小鼠胸主動脈加入液氮研磨;
[0086]
2)配制裂解液,10ulpmsf(100mm)+1ml ripa裂解液混勻后放置冰上待用;
[0087]
3)研磨好的組織加入600μl含pmsf的裂解液,于冰上裂解30min,為使細胞充分裂解,要經常上下顛倒離心管;
[0088]
4)將離心管置于4℃,12000rpm離心5min,將離心后端上清分裝至干凈的離心管中,分裝至少2份,于-80℃保存。
[0089]
1.1.3 bca法測定蛋白濃度
[0090]
1)將蛋白標準配制液1.2ml加入到30mg bsa中,蛋白標準溶液終濃度為25mg/ml;
[0091]
2)取適量25mg/ml蛋白標準,稀釋至終濃度為0.5mg/ml;
[0092]
3)按照bca試劑a:b=50:1的比例配制bca工作液,混勻后備用;
[0093]
4)按照0、1、2、4、8、12、16、20μl的容量,將標準品加到96孔板中,用標準品稀釋液稀釋至20μl,標準品濃度如表中所示,并制作標準曲線:
[0094][0095]
5)樣品孔加入10μl待測樣品蛋白,各孔加入200μl bca工作液,37℃孵育30min;
[0096]
6)酶標儀在562nm處檢測od值,繪制標準曲線,并計算樣品蛋白濃度,取適量上清和5x上樣緩沖液按4:1混合,煮沸10min,緩慢恢復至室溫,稍離心,于-20℃保存。
[0097]
1.1.4 sds-page電泳
[0098]
1)將跑膠用的玻璃板及玻璃內板用清潔劑和柔軟的擦布清洗干凈,放置在玻璃板架上,烘箱烤干或者自然風干;
[0099]
2)將干燥后的玻璃板用用制膠框夾好,并在平整的桌面上保持玻璃外板與玻璃內板底部對齊,然后將裝有玻璃板的制膠框固定在帶封邊墊條的制膠支架上,防止漏膠;
[0100]
3)按下表配制sds-page分離膠混合液:
[0101][0102]
4)按下表配制sds-page濃縮膠混合液:
[0103][0104]
5)將配制好的sds-page分離膠混合液用移液槍迅速加入玻璃外板與內板的夾層中,在分離膠上注滿蒸餾水,室溫靜置30min;
[0105]
6)待分離膠凝固后,將分離膠上層蒸餾水用移液槍小心吸出,并用濾紙吸去多余的蒸餾水,在分離膠上層注滿配制好的sds-page濃縮膠混合液,立即小心插入齒梳,室溫靜置30min至濃縮膠完全凝固;
[0106]
7)將玻璃板取下,放入垂直電泳槽固定架中,然后將固定架放入電泳槽中,在電泳槽中緩慢加入1x電泳緩沖液,注意緩沖液必須淹沒上樣孔頂端;
[0107]
8)加入3μl marker和蛋白樣品,按順序依次上樣;
[0108]
9)電泳:電壓先設置80v,待marker到達分離膠后,設置120v電壓直至marker電泳至分離膠底部為止。
[0109]
1.1.5轉膜
[0110]
1)將目的蛋白所在的分離膠泳道裁剪下來,做好標記,準備好面積稍大于分離膠的pvdf膜;
[0111]
2)將pvdf膜用甲醇預處理5s,然后放置在轉膜緩沖液30min;
[0112]
3)將電泳好的凝膠取出,小心放置在濾紙上,再將處理好的pvdf膜覆蓋在凝膠上,在pvdf膜上再蓋濾紙,形成濾紙,凝膠,pvdf膜,濾紙的“三明治”凝膠轉印堆積結構,注意操作過程中不能產生氣泡;
[0113]
4)按照轉印夾中的正負極指示,將“三明治”堆積結構正確放入;
[0114]
5)轉膜(18v,10min)
[0115]
1.1.6免疫印記
[0116]
2)轉膜完成后,pvdf膜用tbst漂洗5min,1次;
[0117]
3)放入封閉液中室溫封閉1h;
[0118]
4)封閉后用tbst漂洗5min,1次;
[0119]
5)一抗4℃過夜;
[0120]
6)置于脫色搖床上,tbst漂洗5min,3次;
[0121]
7)二抗室溫孵育1h;
[0122]
8)置于脫色搖床上,tbst漂洗5min,3次;
[0123]
9)將pvdf膜放置在透明板上,并保持濕潤;
[0124]
10)用移液槍將beyoecl star顯影液均勻地覆蓋pvdf膜表面,反應5min;
[0125]
11)去除多余的顯影液;
[0126]
12)顯影;
[0127]
13)imagej軟件分析結果。
[0128]
四.rt-pcr檢測,結果如圖4所示。
[0129]
逆轉錄
[0130]
1)在pcr管中準備以下溶液:
[0131][0132]
2)將以上溶液混勻,85℃5min,之后馬上制冷,防止復性;
[0133]
3)在pcr管中配置以下試劑:
[0134][0135]
4)反應條件如下:樣品體積體積20μl、30℃10min、42℃60min、85℃10min定量pcr:
[0136]
1)反應體系:
[0137][0138][0139]
2)反應條件:50℃8min;95℃8min;95℃15s,60℃32s,40cycles;
[0140]
引物:
[0141][0142]
血壓結果如圖2所示:tf4
+/-小鼠經過正常飲食和高鹽飲食后,在第4、8、12、16、20、24、28天兩組收縮壓之間均無統計學意義(p>0.05),見圖展示了atf4
+/-兩組各個時間點收縮壓的檢測值
[0143]
血瘀癥相關指標如圖3所示:小鼠elisa結果顯示,wt-hs組與wt-ns、ko-hs組相比,et-1、epcr、tm、vwf、pai顯著增加,no、tpa減少(ap《0.05,cp《0.05);wt-ns、ko-ns、ko-hs各組之間no、et-1、epcr、tm、vwf、tpa、pai無明顯變化(p>0.05)
[0144]
atf4蛋白表達量如圖5所示:小鼠western blot結果顯示,與wt-ns組比較,ko-ns組atf4蛋白表達降低(bp《0.05);wt-hs組與wt-ns、ko-hs組相比,atf4、chop蛋白表達顯著增加(ap《0.05,cp《0.05);ko-ns、ko-hs兩組之間atf4、chop蛋白表達無明顯變化(p>0.05)
[0145]
atf4基因表達量如圖6所示:小鼠pcr結果顯示,與wt-ns組比較,ko-ns組atf4 mrna表達降低(bp《0.05);wt-hs組與wt-ns、ko-hs組相比,atf4、chopmrna表達顯著增加(ap《0.05,cp《0.05);ko-ns、ko-hs兩組之間atf4、chop mrna表達無明顯變化(p>0.05)
[0146]
上述僅為本發明的一個具體導向實施方式,但本發明的設計構思并不局限于此,凡利用此構思對本發明進行非實質性的改動,均應屬于侵犯本發明的保護范圍的行為。
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