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一種具有多種生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制備方法與流程

文檔序號:29648117發布日期:2022-04-13 21:44來源:國知局
一種具有多種生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制備方法與流程

1.本發明屬于食品開發技術領域,具體涉及一種具有多種生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制備方法。


背景技術:

2.活性肽是介于氨基酸與蛋白質之間的分子聚合物,它小至由兩個氨基酸組成,大至由數百個氨基酸通過肽鍵連接而成,具有十分重要的生物學意義。主要體現在其吸收機制優于氨基酸和具有氨基酸不可比擬的生理功能兩個方面,其生理功能主要有類嗎啡樣活性、激素和調節激素的作用,對生物體內的酶具有調節和抑制功能,改善和提高礦物質運輸和吸收,抗菌和病毒,提高免疫力,抗氧化,清除自由基抗衰老以及抗高血壓和高血脂等。
3.肽是蛋白質與氨基酸的中間物質,由數個氨基酸結合而成。分子大小介于蛋白質與氨基酸之間。比氨基酸分子大的肽在人體內被吸收的速度反而比氨基酸更快,原因就在于:寡聚肽是數個氨基酸分子集中起來被整體吸收,而氨基酸需要一個一個地被吸收,寡聚肽能比氨基酸更迅速地被人體吸收。
4.大豆多肽指大豆蛋白質經蛋白酶作用,再經特殊處理后得到的蛋白質分解物。大豆多肽本身由許多分子鏈長度不等的低分子小肽混合組成。通常由3~6個氦基酸組成相對分子量低于1000的低肽混合物,肽類相對分子量主要在300da~700da范圍內。分子量段在50~2000之間的稱為小肽、寡肽、低聚肽,一般普遍認為分子量在1000的小分子肽最好,這個分子量的大豆肽即能保證很好地被人體吸收,又可以保證肽的功能性與活性。研究發現大豆蛋白的酶解產物具有許多生理功能,如在人體內大豆多肽比大豆蛋白更易被消化吸收,抗原性較低;具有促進人體內脂肪代謝,肌紅細胞的復原,降膽固醇的功能,抑制血壓升高,增強免疫功能和抗自由基損傷(延緩衰老)。
5.大豆活性多肽的多種營養特性、生理活性以及保健功能,使得其具有廣闊的開發空間和市場潛力。但國內大豆活性多肽應用仍處于初級開發應用階段,蛋白質酶解機理與過程控制缺乏系統深入研究,水解度與酶解產物特性關系尚未明確,使得水解工藝控制缺乏一定理論指導,分離純化過程工藝還不成熟,有待于找到一種較合適的分離方法來提純大豆多肽。
6.目前主要通過酶解技術可以獲得大豆活性肽,但酶解后的大豆肽的轉化率不僅低,且分子量小于1000da的占比少,使大豆活性肽難以實現工業化利用,同時提高了大豆活性肽的生產成本。因此為了使大豆活性肽更好的應用到實際生產中,需要開發一種具有多種生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制備方法。


技術實現要素:

7.針對現有技術的上述問題,本發明提供了一種具有多種生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制備方法。本發明使用超聲波處理濕法磷酸化的大豆分離蛋白,通過把糖苷類化合物綴合在蛋白酶上提高蛋白酶的酶活及穩定性;在行星球磨機的運作下,增加大豆分離蛋
白與蛋白酶的碰撞與接觸的機會,加速酶促反應進程,提高大豆寡聚肽的得率。
8.本發明為了實現上述目的采用的技術方案是:
9.一種具有多種生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制備方法,包括以下步驟:
10.(1)超聲波處理濕法磷酸化的大豆分離蛋白:按照1:5-15的重量比例將大豆分離蛋白添加進ph為7-10的磷酸鈉緩沖溶液中制備得到濕法磷酸水溶液,然后用超聲波處理器處理濕法磷酸水溶液,得到濕法磷酸化的大豆分離蛋白溶液;
11.(2)蛋白酶改性處理:將糖苷類化合物分別與中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶通過濕熱美拉德反應改性,制備得到糖苷類化合物-蛋白酶綴合物,具體方法為:糖苷類化合物分別與四種蛋白酶按重量比1:10-40混合,混合物在室溫下磁力攪拌10-60min,然后在30-60℃的水浴中磁力攪拌12-48h;
12.(3)大豆分離蛋白的酶解:將步驟(2)制得的四種糖苷類復合物-蛋白酶綴合物依次加入步驟(1)制得的大豆分離蛋白溶液中,然后放入立式生產行星式球磨機的球磨罐中進行酶解,制得酶解液;
13.(4)大豆寡聚活性肽粉的分離:將步驟(3)得到的酶解液首先經過陶瓷膜進行初級過濾,然后把經過初級過濾的清液利用超濾膜進行超濾分級,最后把超濾分級得到的清液利用納濾設備進行納濾濃縮,得到的濃縮液即為大豆寡聚活性肽濃縮液;
14.(5)噴霧干燥制備大豆寡聚活性肽粉末:使用噴霧干燥機對步驟(4)制備的大豆寡聚活性肽濃縮液進行噴霧干燥,經過噴霧干燥后可得大豆寡聚活性肽粉。
15.優選的,步驟(1)中所述的超聲波處理器超聲功率100-1200w,脈沖持續時間:1-10秒開啟,1-10秒關閉,超聲時間為10-40min,超聲處理過程的溫度控制在25-70℃。
16.優選的,步驟(2)中所述的糖苷類化合物為葡萄糖乙酸酯、葡萄糖丁酸酯、葡萄糖丙酸酯的至少一種。
17.優選的,步驟(3)中所述的酶解反應條件為:ph為6-11,溫度為35-60℃,每種酶的添加量為0.01-0.5%,酶解時間為1-6h。
18.優選的,步驟(3)中所述的立式生產行星式球磨機以100-800轉/分的恒定研磨速度旋轉,球磨機旋轉方向每1-10min改變一次。
19.優選的,步驟(4)中所述的陶瓷膜的孔徑為小于0.2μm,超濾膜的可通過的分子量為不大于1000da,,納濾膜的可通過的分子量為不大于150da,大豆寡聚活性肽粉濃縮液的固含物含量大于等于10%。
20.優選的,步驟(5)中所述的噴霧干燥條件為:干燥溫度120-200℃,噴霧壓力1-8mpa。
21.優選的,步驟(1)中所述的超聲波處理器為dy-1200c,20khz,最大功率為1200w,生產廠家為中國上海德陽億邦儀器有限公司。
22.優選的,步驟(3)中所述的立式生產行星式球磨機為凈信高能行星式球磨機jx-2/4/5g。
23.本發明有益的技術效果在于:
24.(1)本發明使用超聲處理濕法磷酸化的大豆分離蛋白,超聲處理導致蛋白的二級結構改變從而誘導三級結構的改變,進而對蛋白的功能特性造成影響。超聲處理后,濕法磷酸中的大豆分離蛋白聚集體尺寸減小,且蛋白的發泡性、乳化性和抗氧化性能均有所提高。
在酶解處理前對大豆分離蛋白進行超聲處理,不僅可以提高蛋白的溶解度,還可以使大豆分離蛋白的空間結構舒展開,為蛋白酶酶解提供更多的底物結合位點,可以使下一步酶解進行的更加徹底。
25.(2)本發明采用使用的葡萄糖乙酸酯、葡萄糖丁酸酯、葡萄糖丙酸酯類化合物通過濕熱美拉德反應綴合在蛋白酶上,使蛋白酶的結構發生改變,提高蛋白酶的酶活及穩定性,從而改變蛋白酶的酶促反應進程。本方法具有使大豆分離蛋白被酶解的更加徹底,大豆寡聚肽的得率高的顯著優點。
26.(3)本發明使用的行星球磨機能用干、濕兩種方法粉碎并混和粒度不同、材料各異的產品,效率高、效能大、研磨產品最小粒度可至0.1微米(即1.0
×
10-4
mm)甚至納米級。酶解反應在行星球磨機中進行可以使大豆分離蛋白在酶解的過程中剪切成更小的粒度,不僅可以增加大豆分離蛋白的溶解,還可以使酶促反應進程進行的更加徹底,而且在行星球磨機的運作下,可以增加大豆分離蛋白與蛋白酶的碰撞與接觸的機會,極大的加速了酶促反應進程??梢源蟠蠼档蛯嶋H生產過程酶解所消耗的時間與生產成本。
具體實施方式
27.下面結合實施例,對本發明進行具體描述。顯然,所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例?;诒景l明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明保護的范圍。
28.實施例1:
29.(1)超聲波處理濕法磷酸化的大豆分離蛋白:按照1:5比例將大豆分離蛋白添加進ph為7為磷酸鈉緩沖溶液中制備得到濕法磷酸水溶液,然后用超聲波處理器處理濕法磷酸水溶液,得到濕法磷酸化的大豆分離蛋白溶液,具體方法為:超聲波處理器超聲功率100w,脈沖持續時間:1秒開啟,1秒關閉,超聲時間為10min,超聲處理過程的溫度控制在70℃。
30.(2)蛋白酶改性處理:葡萄糖乙酸酯(包括各個位點的單乙酸酯以及各個位點組合的二乙酸酯)分別與中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶通過濕熱美拉德反應改性,具體方法為:將葡萄糖乙酸酯分別與四種蛋白酶按重量比1:10混合,混合物在室溫下磁力攪拌10min,然后在60℃的水浴中磁力攪拌12h。
31.(3)大豆分離蛋白的酶解:將步驟(2)制得的四種葡萄糖乙酸酯-蛋白酶綴合物依次加入步驟(1)制得的大豆分離蛋白溶液中,然后放入立式生產行星式球磨機的球磨罐中進行酶解,立式生產行星式球磨機以100轉/分的恒定研磨速度旋轉,球磨機旋轉方向每1min改變一次,得到酶解液。酶解反應條件為:ph為6,溫度為60℃,每種酶的添加量為0.01%,酶解時間為1h。
32.(4)大豆寡聚活性肽粉的分離:將(3)步驟得到的酶解液首先經過孔徑小于0.2μm的陶瓷膜進行初級過濾,然后把經過初級過濾的清液利用可通過分子量不大于1000da的超濾膜進行超濾分級,最后把超濾分級得到的清液利用可通過分子量不大于150da納濾設備進行納濾濃縮,得到的濃縮液即為大豆寡聚活性肽濃縮液。得到的大豆寡聚活性肽濃縮液固含物含量大于等于10%。
33.(5)噴霧干燥制備大豆寡聚活性肽粉末:使用噴霧干燥機對步驟(4)制備的大豆寡聚活性肽濃縮液進行噴霧干燥,經過噴霧干燥后可得大豆寡聚活性肽粉,干燥溫度為120
℃,噴霧壓力為8mpa。
34.實施例2
35.(1)超聲波處理濕法磷酸化的大豆分離蛋白:按照1:10比例將大豆分離蛋白添加進ph 8為磷酸鈉緩沖溶液中制備得到濕法磷酸水溶液,然后用超聲波處理器處理濕法磷酸水溶液,得到濕法磷酸化的大豆分離蛋白溶液,具體方法為:超聲波處理器超聲功率800w,脈沖持續時間:5秒開啟,5秒關閉,超聲時間為25min,超聲處理過程的溫度控制在45℃。
36.(2)蛋白酶改性處理:葡萄糖丁酸酯(包括各個位點的單丁酸酯以及各個位點組合的二丁酸酯)分別與中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶通過濕熱美拉德反應改性,具體方法為:將葡萄糖丁酸酯分別與四種蛋白酶按重量比1:25,混合物在室溫下磁力攪拌30min,然后45℃的水浴中磁力攪拌24h。
37.(3)大豆分離蛋白的酶解:將步驟(2)制得的四種葡萄糖丁酸酯-蛋白酶綴合物依次加入步驟(1)制得的大豆分離蛋白溶液中,然后放入立式生產行星式球磨機的球磨罐中進行酶解,立式生產行星式球磨機以500轉/分的恒定研磨速度旋轉,球磨機旋轉方向每5min改變一次,得到酶解液。酶解反應條件為:ph為8,溫度為45℃,每種酶的添加量為0.2%,酶解時間為3h。
38.(4)大豆寡聚活性肽粉的分離:將(3)步驟得到的酶解液首先經過孔徑小于0.2μm的陶瓷膜進行初級過濾,然后把經過初級過濾的清液利用可通過分子量不大于1000da的超濾膜進行超濾分級,最后把超濾分級得到的清液利用可通過分子量不大于150da納濾設備進行納濾濃縮,得到的濃縮液即為大豆寡聚活性肽濃縮液。得到的大豆寡聚活性肽濃縮液固含物含量大于等于10%。
39.(5)噴霧干燥制備大豆寡聚活性肽粉末:使用噴霧干燥機對步驟(4)制備的大豆寡聚活性肽濃縮液進行噴霧干燥,經過噴霧干燥后可得大豆寡聚活性肽粉,干燥溫度為180℃,噴霧壓力為5mpa。
40.實施例3
41.(1)超聲波處理濕法磷酸化的大豆分離蛋白:按照1:15比例將大豆分離蛋白添加進ph10為磷酸鈉緩沖溶液中制備得到濕法磷酸水溶液,然后用超聲波處理器處理濕法磷酸水溶液,得到濕法磷酸化的大豆分離蛋白溶液,具體方法為:超聲波處理器超聲功率1200w,脈沖持續時間:10秒開啟,10秒關閉,超聲時間為40min,超聲處理過程的溫度控制在25℃。
42.(2)蛋白酶改性處理:葡萄糖丙酸酯(包括各個位點的單丙酸酯以及各個位點組合的二丙酸酯)分別與中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶通過濕熱美拉德反應改性,具體方法為:將葡萄糖丙酸酯分別與四種蛋白酶按重量比1:40混合,混合物在室溫下磁力攪拌60min,然后在30℃的水浴中磁力攪拌48h。
43.(3)大豆分離蛋白的酶解:將步驟(2)制得的四種葡萄糖丙酸酯-蛋白酶綴合物依次加入步驟(1)制得的大豆分離蛋白溶液中,然后放入立式生產行星式球磨機的球磨罐中進行酶解,立式生產行星式球磨機以800轉/分的恒定研磨速度旋轉,球磨機旋轉方向每10min改變一次,得到酶解液。酶解反應條件為:ph為11,溫度為35℃,每種酶的添加量為0.5%,酶解時間為6h。
44.(4)大豆寡聚活性肽粉的分離:將(3)步驟得到的酶解液首先經過孔徑小于0.2μm的陶瓷膜進行初級過濾,然后把經過初級過濾的清液利用可通過分子量不大于1000da的超
濾膜進行超濾分級,最后把超濾分級得到的清液利用可通過分子量不大于150da納濾設備進行納濾濃縮,得到的濃縮液即為大豆寡聚活性肽濃縮液。得到的大豆寡聚活性肽濃縮液固含物含量大于等于10%。
45.(5)噴霧干燥制備大豆寡聚活性肽粉末:使用噴霧干燥機對步驟(4)制備的大豆寡聚活性肽濃縮液進行噴霧干燥,經過噴霧干燥后可得大豆寡聚活性肽粉,干燥溫度為200℃,噴霧壓力為1mpa。
46.測試例:
47.測定了實施例制備的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、抑制脂過氧化自由基清除率。
48.具體測定方法如下,測定結果如表1所示。
49.(1)
50.(2)抗原活性剩余率:采用競爭法酶聯免疫分析(elisa)測定酶解產物的抗原性。操作步驟按試劑盒說明書進行。以抗原性剩余率表示酶解去除抗原效果。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(od值),并通過標準曲線計算樣品中抗原蛋白濃度。以抗原性剩余率表示酶解去除抗原效果。
51.(3)dpph自由基消除率:取1.00ml 1%的大豆寡聚活性肽水溶液,加入4.00ml的100μmol/l dpph乙醇溶液混勻,避光放置30min,以原溶劑調零,在517nm處測定吸光度記為ai;同法取1.00ml溶劑加入4.00mldpph溶液混勻,測定吸光度記為ac;取1.00ml水解物加入4.00ml的溶劑混勻,測定吸光度記為aj。dpph自由基消除率計算公式為:
52.自由基清除率(%)=[1-(ai-aj)/ac]
×
100%。
[0053]
(4)abts自由基清除率:abts儲備液配制:取1.72mg過硫酸鉀和10mg abts溶于2.6ml、ph=7.4pbs緩沖液中,在室溫下避光靜置12~16h后,用ph=7.4pbs緩沖液稀釋,使其在酶標儀734nm下吸光度值為0.7
±
0.02,得abts工作液(現用現配)。實驗分為空白組、對照組和樣品組三組。
[0054]
空白組ab:每孔加入200μlpbs緩沖液;
[0055]
對照組ac:每孔加20μlpbs和180μlabts工作液;
[0056]
實驗組as:每孔加20μl樣品溶液和180μlabts工作液;
[0057]
放置于振蕩器振蕩10s,室溫條件下避光反應5min,用酶標儀測定其在734nm處的吸光度值,abts自由基清除率計算公式為:
[0058]
abts自由基清除率(%)=(ac-as)/(ac-ab)
×
100%
[0059]
(5)羥基自由基(
.
oh)清除率:采用d-脫氧核糖-fe體系法。吸取0.1ml1%的大豆寡聚活性肽水溶液,移入試管中,加0.1ml1.04mmol/l edta溶液、0.1ml1 mmol/l fecl3溶液、0.1ml2 mmol/l vc溶液、0.1ml10 mmol/l h2o2溶液、0.1ml60 mmol/l dr溶液和0.4ml ph 7.5kh2po
4-naoh緩沖溶液。37℃水浴1h,加1ml 25%hcl溶液終止反應,加1ml 1%硫代巴比妥酸(tba)溶液,100℃水浴15min,冷卻后有沉淀,加入1ml正丁醇萃取顏色,然后于532nm波長處測定吸光值。以空白作參比,按下式計算。
[0060]
羥基自由基清除率(%)=[(a0-(a1-a2)/a0]
×
100%
[0061]
式中:a0-不加樣品的空白吸光度;
[0062]
a1-加入樣品和2-脫氧-d-核糖的吸光度;
[0063]
a2-樣品在體系中吸光度(不加dr)
[0064]
(6)超氧陰離子自由基(o2-)清除率的測定:采用改良的鄰苯三酚自氧化法。
[0065]ⅰ、預熱:將ph 8.2的tris-hcl-edta緩沖液和45mmol/l的鄰苯三酚溶液于25℃水浴中預熱20min。
[0066]ⅱ、鄰苯三酚自氧化速率的測定:取ph 8.2的tris-hcl-edta緩沖液4.5ml于試管中,再加入一定量的鄰苯三酚溶液,迅速混勻于325nm波長下測a0,以10mmol/l鹽酸作對照,反應4min,使

a/4(即a0)在0.272~0.288之間,記下所用鄰苯三酚體積,以后每次加樣都用此體積。
[0067]ⅲ、抗氧化活性的測定:取ph8.2的tris-hcl-edta緩沖液4.5m l,加入5%的樣品溶液,加入量與上面確定的鄰苯三酚溶液添加量相同,再加入等體積的鄰苯三酚溶液迅速混勻,在325nm波長進行時間掃描,獲得as。
[0068]ⅳ、計算
[0069][0070]
式中:v1:樣液總體積/ml;
??
v:加入樣品體積/ml;
[0071]
n:樣品稀釋倍數;
??
a0:鄰苯三酚的自氧化速率;as:加肽后鄰苯三酚的自氧化速率;m:樣品質量/g;
[0072]
4.5:反應液總體積。
[0073]
(7)抑制脂過氧化自由基(roo
·
)清除率測定:采用亞油酸脂質過氧化體系法。取50μl 1%的大豆寡聚活性肽水溶液與974μl蒸餾水,26μl亞油酸,2m l無水乙醇,2ml50 mmol的p h7.0的磷酸緩沖液混合,40℃暗處反應12h。取上述混合物50μl加入0.8ml的蒸餾水、0.2ml8.1%sds、1.5ml20%ph3.5的醋酸溶液、1.5ml0.8%巴比妥酸。將上述反應液在100℃加熱60min,冷卻,在532nm處測定吸光度值。以空白作參比,按下式計算:aa%=(a
0-as)/a0×
100%
[0074]
式中:aa-對脂過氧化自由基的抑制率
[0075]
a0-抗氧化劑空白樣的吸光度
[0076]as
-加抗氧化劑樣品的吸光度
[0077]
表1(單位:%)
[0078][0079]
由表1可以得出,實施例2最佳。制備的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量占比、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、抑制脂過氧化自由基清除率的效果最優。
[0080]
在實施例2的基礎上,設置對照例:
[0081]
對比例1:濕法磷酸的超聲波處理大豆分離蛋白,其他加工工藝與實施例2相同。
[0082]
對比例2:蛋白酶改性處理,其他加工工藝與實施例2相同。
[0083]
對比例3:省去糖苷類復合物,改用葡萄糖,其他加工工藝與實施例2相同。
[0084]
對比例4:省去行星式球磨機,改用磁力攪拌機,其他加工工藝與實施例2相同。
[0085]
測定了實施例制備的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、抑制脂過氧化自由基清除率。
[0086]
具體測定方法與測試例相同,測定結果如表2所示。
[0087]
表2(單位:%)
[0088][0089]
由表2可以得出,實施例2最佳,其制備的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量占比、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、抑制脂過氧化自由基清除率都是最佳。
[0090]
盡管本發明的實施方案已公開如上,但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用,它完全可以被適用于各種適合本發明的領域,對于熟悉本領域的人員而言,對于本領域的普通技術人員而言,在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下,本發明并不限于特定的細節。
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