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一種檢測惡性血液病IKZF家族基因突變的引物組合及方法

文檔序號:29648068發布日期:2022-04-13 21:41來源:國知局
一種檢測惡性血液病IKZF家族基因突變的引物組合及方法
一種檢測惡性血液病ikzf家族基因突變的引物組合及方法
技術領域
1.本發明涉及生物醫藥技術領域,具體是一種檢測惡性血液病ikzf家族基因突變的引物組合及方法。


背景技術:

2.ikzf家族由若干具有鋅指結構的轉錄調控蛋白組成,其n末端鋅指結構具有dna結合功能,而c末端鋅指結構用于ikzf家族成員之間的相互識別并結合形成同源或異源二聚體。ikzf家族成員主要包括ikaros、helios、aiolos、eos和pegasus,分別由ikzf1-5基因編碼。ikzf1和ikzf2在淋系細胞的增殖和分化調控中起重要作用。同時,研究表明ikzf1和ikzf2的異構體在白血病的發生和發展中具有重要作用。ik-6是指ikzf13-6外顯子缺失,是至今發現的在白血病發病機制中最重要的ikzf1異構體,是目前公認的一種高危預后標記。 ikzf2是調節性t細胞的標志基因,在腫瘤微環境中起重要作用,其基因突變與腫瘤轉移、治療方案選擇及預后有密切相關性。ikzf3編碼的aiolos蛋白,在淋巴細胞的分化發育中起著至關重要的作用。ikzf3突變在b細胞惡性腫瘤、慢性淋巴細胞白血病的發生發展中起關鍵作用。ikzf4和ikzf5也是重要的血細胞發育基因,在血液腫瘤細胞中表達量高。其基因突變不僅與腫瘤發生發展有關,還與血小板減少癥的病理生理關系密切,提示其基因突變可指導患者預后分層及臨床治療選擇。目前有研究報道,ikzf家族基因在急性白血病和骨髓增生異常綜合征患者中突變比例較其他惡性血液病更高,且與患者預后相關,被認為是疾病的驅動因素。然而,目前只有ikzf1基因突變用于臨床某些惡性血液病的檢測和分型。因此,研發新方法全面檢測ikzf家族5個成員在惡性血液病中的突變特征和分布,對其臨床分型、預后判斷及治療方案選擇等方面具有非常重要的意義。
3.傳統的形態學結合流式免疫分型已不能滿足精準醫療時代對惡性血液病患者診斷的需求。隨著高通量測序技術的發展,發現了越來越多的與惡性血液病相關的分子學異常。攜帶這些分子學異常的患者往往臨床治療困難,易復發,預后差。早期識別新靶點進行精準個體化治療成為今后治療方向。但是,目前只有ikzf1突變檢測包含在某些白血病高通量測序檢測組套中,缺乏完整ikzf 家族5個成員基因突變的高通量檢測方法。因此迫切需要開發針對ikzf家族基因突變更加全面、高效、簡便的檢測新方法,早期識別該家族基因分子學異常,有望為患者提供更精準的個體化治療、改善預后和生存,有極大的臨床價值和應用前景。
4.多重pcr技術可以在一個pcr反應體系里加入多對引物進行擴增,結合高通量測序技術,可用于待檢測位點擴增后的測序。在一個pcr反應體系里加入多對待檢測位點引物可以大大縮減工作量和試劑成本,同時又可滿足臨床希望全面、準確、快速地獲取檢測結果的需求,真正做到對惡性血液病患者進行精準、高效的高危亞型篩查。然而,在一個pcr反應體系里加入多對引物勢必會增大引物二聚體形成的概率,導致檢測效率的降低。因此,多重pcr引物及其組合的設計和優化是該技術的重點和難點,引物越多,設計難度越大。鑒于以上難點,本發明將針對ikzf1-5基因設計引物及其組合并優化,以適應臨床檢測特點和需
求。


技術實現要素:

5.本發明的目的在于提供一種檢測惡性血液病ikzf家族基因突變的引物組合及方法,解決惡性血液病患者目前ikzf基因突變檢測不能全面覆蓋ikzf1-5 基因、檢測困難、耗時、敏感性和精準性低等瓶頸技術問題,基于多重pcr結合高通量測序技術的引物組合和方法,用于檢測惡性血液病患者ikzf1-5基因突變;方法中的引物及其組合經過多次優化,特異性、敏感性和精準性高;該技術應用于惡性血液病患者ikzf家族基因突變的檢測,發揮指導臨床精準分型診斷、早期篩查高危亞型、預后評估和個體化靶點治療的重要作用。
6.本發明的目的可以通過以下技術方案實現:
7.一種檢測惡性血液病ikzf家族基因突變的引物組合,包括ikzf1-5基因外顯子測序的71對引物,分為兩個引物池,36對引物組成第一個引物池m1,35 對引物組成第二個引物池m2。
8.進一步地,所述m1引物池序列包括m1-1f~m1-36f和m1-1r~m1-36r,m2 引物池序列包括m2-1f~m2-35f和m2-1r~m2-35r。
9.引物組合檢測ikzf家族基因突變的方法,步驟如下:
10.一、惡性血液病患者單個核細胞的分離
11.1.1將采血管配平后置于低速離心機中,2500rpm
×
5min。離心后緩慢吸棄上層血漿,用無菌生理鹽水將剩下的血細胞稀釋至5ml,充分吹打混勻;
12.1.2取15ml離心管,標記患者姓名后加入5ml人淋巴細胞分離液,再沿管壁緩慢將骨髓或外周血稀釋液滴加于淋巴細胞分離液之上,形成分層,避免兩者混合;
13.1.3采用密度梯度離心法,將離心管置于低速離心機中(注意配平),2000rpm

20min;離心后管中液體分為三層,上層清亮層為稀釋的血漿和血小板,中間白膜層為單個核細胞,下層紅色層為粒細胞和紅細胞;
14.1.4緩慢吸取中間單個核細胞層,放置于另一標記患者姓名的潔凈離心管中,加入10ml無菌生理鹽水吹打混勻后置于低速離心機離心,2000rpm
×
5min,棄上清;
15.1.5用1ml無菌生理鹽水重懸洗滌后的細胞團塊,在高倍顯微鏡下用細胞計數板計數,計算總細胞量(細胞計數液為1%的冰醋酸,20μl細胞懸液加入到380μl的1%冰醋酸中吹打混勻,相當于稀釋20倍;吸20μl加入到細胞計數板,鏡下計數16個格子里的細胞數n,則細胞總量為n
×
10000
×
20);
16.1.6將細胞懸液稀釋到1
×
107個單個核細胞/ml;1.5ml ep管中分裝細胞懸液,每管1ml;配平后高速(8000rpm)瞬時離心,小心吸棄上清,勿觸及管底細胞沉淀。在管壁標注好編號和患者姓名。
17.二、細胞基因組dna的提取
18.dna提取純化所用試劑購自qiagen公司(qiaamp dna blood mini kit)試劑盒,方法為硅膜吸附法,具體如下:
19.2.1將分離得到的5
×
106個惡性血液病患者單個核細胞溶解于200μl pbs 中,于管底加入20μl蛋白酶k(試劑盒提供,按使用說明配制,4℃保存);
20.2.2緩慢加入200μl油狀裂解液al,震蕩混勻后低速瞬離;
21.2.3 56℃水浴20min,待油狀混合液變澄清,擦凈外壁液體后低速瞬離,以將黏附在內壁和管蓋的液體離心至管底;
22.2.4加入200μl無水乙醇,顛倒混勻,低速瞬離,除去管壁液體;
23.2.5將步驟2.4所得的混合液小心轉移至qiaamp mini吸附柱中(吸附柱置于試劑盒提供的2ml收集管上),蓋好管蓋,做好標記,高速離心12000rpm

3min,丟棄收集管及濾液;
24.2.6吸附柱放入新的收集管(試劑盒提供)中,在吸附柱中加入500μl緩沖液aw1(按產品說明書加入無水乙醇混勻),蓋好管蓋并離心,12000rpm
×
3min,丟棄收集管及濾液;
25.2.7吸附柱放入新的收集管(試劑盒提供)中,加入500μl緩沖液aw2(按產品說明書加入無水乙醇混勻),蓋好管蓋并離心,12000rpm
×
3min,丟棄收集管及濾液;
26.2.8將吸附柱置于自備的清潔無菌1.5ml ep管中,打開吸附柱管蓋,離心12000rpm
×
3min,使乙醇充分揮發,丟棄ep管及濾液;
27.2.9將吸附柱置于自備的清潔無菌1.5ml ep管中,懸空滴加100μl洗脫緩沖液ae,將ae滴加在吸附柱的吸附膜中間部位,室溫孵育3min以充分洗脫吸附膜中的dna,離心12000rpm
×
3min,此時ep管中的濾液即為基因組dna 溶液;
28.2.10為提高dna的收集效率,重復步驟2.9,將ep管中收集到的dna溶液返回加入吸附柱中,小心加在吸附柱的吸附膜中間部位,室溫孵育3min以充分溶解吸附膜中的dna,離心12000rpm
×
3min,再次收集dna溶液;
29.2.11使用nanodrop one微量紫外可見分光光度計檢測基因組dna的濃度和純度,od260/280比值在1.8-2.0間的dna質量符合要求,可用于本發明dna 文庫的構建以及高通量測序。
30.三、dna文庫構建,測序
31.3.1ikzf1-5基因外顯子pcr擴增子序列
32.所檢測的71個擴增子信息如下表:
33.34.[0035][0036]
針對ikzf1-5基因外顯子序列設計引物,引物合成由上海生工公司完成。由于引物數量多,為避免形成引物二聚體影響擴增效率,將設計好的引物分為2 個引物池(m1和m2),其中m1為36對引物,m2為35對引物,引物具體序列信息如下表:
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042][0043]
3.2準備并定量pcr擴增模板
[0044]
使用美國life technologies公司qubit dsdna hs assay kit,貨號q32850 檢測pcr反應dna模板濃度,保證每個反應體系加入20-60ng dna。
[0045]
3.2.1將試劑盒置于室溫;
[0046]
3.2.2取試劑盒中dsdna hs reagent(組份a),按1:200用buffer(組份 b)稀釋,配成工作液,現配現用;1μl組份a+199μl組份b;
[0047]
3.2.3向分析管中加入配制的工作液190μl;
[0048]
3.2.4在分析管中分別加入dsdna standard#1、standard#2和稀釋10倍的 dsdna樣本,每管10μl,正確標記;
[0049]
3.2.5室溫避光孵育2分鐘;
[0050]
3.2.6檢測樣本濃度。
[0051]
3.3基因特異性pcr
[0052]
pcr擴增反應體系為(所用試劑為生工公司的高通量測序文庫構建試劑盒):
[0053][0054][0055]
panel a/b的反應體系要分開配制;基因組純度及質量非常重要,如果提取的dna有雜質或者降解嚴重,會導致擴增效率急劇降低。
[0056]
混勻,panel a/b分別置于pcr儀上,運行以下反應程序:
[0057][0058]
3.4回收第一輪擴增產物
[0059]
3.4.1提前半小時將agencourt ampure xp磁珠置于室溫中,充分輕柔混勻,以活化磁珠;
[0060]
3.4.2加入25μl磁珠(1.0倍體積)與25μl反應液(步驟3.3中pcr產物)混合,輕柔吹吸10次混勻,室溫孵育5分鐘。準備80%乙醇(乙醇與nuclease-free水體積比為4:1);
[0061]
3.4.3將ep管放置在磁力架上5min至液體澄清,小心吸棄上清,切勿吸到管壁上的磁珠;
[0062]
3.4.4將ep管保持在磁力架上,沿管壁加入200μl 80%乙醇(現配現用) 室溫放置30秒,棄上清,切勿吸到管壁上的磁珠;
[0063]
3.4.5重復上一步用80%乙醇洗一次;
[0064]
3.4.6將ep管保持在磁力架上干燥2-5min,觀察磁珠表面不再反光即可,切勿過度干燥;
[0065]
3.4.7將ep管從磁力架上取下,加入30μl nuclease-free水,輕柔吹打混勻,室溫放置2min,再將ep管放置在磁力架上至液體澄清;
[0066]
3.4.8小心吸取25μl上清至新pcr管,切勿吸到管壁上的磁珠,做好標記。
[0067]
3.5qubit 3.0定量
[0068]
使用qubit dsdna hs assay kit對回收產物定量,具體同步驟3.2。
[0069]
3.6接頭連接(所用試劑為生工公司的高通量測序試劑盒)
[0070]
配制第二輪pcr反應體系(分panel a/b):
[0071]
試劑體積2x indexing pcr master mix210μli5-primer接頭(10um)1μli7-primer接頭(10um)1μl純化pcr產物30ngnuclease-free水補足至30μl總體積30μl
[0072]
接頭由上海生工公司合成,具體序列為:
[0073]
序號i5-primer接頭i7-primer接頭1agcgctagccgcggtt
2gatatcgattataacc3cgcagacgggacttgg4tatgagtaaagtccaa5aggtgcgtatccactg6gaacatacgcttgtca7acatagcgcaagctag8gtgcgatatggatcga9ccaacagaagttcagg10ttggtgaggacctgaa
[0074]
panel a/b的反應體系要分開配制。此pcr接頭的引物有兩種,分別是i5index和i7 index,每個引物有數字編號,對于不同的樣品,需要組合使用,而同一樣本的panel a及panel b需使用同一組合。同一批不同樣品的index組合不能重復,否則會導致數據無法拆分。
[0075]
3.7.混勻后快速離心,置于pcr儀上,運行以下反應:
[0076][0077][0078]
3.8文庫純化
[0079]
3.8.1提前半小時將agencourt ampure xp磁珠置于室溫中,充分輕柔混勻,以活化磁珠;
[0080]
3.8.2加入22.5μl磁珠(0.9倍體積)與25μl反應液(步驟3.7中pcr 產物)混合,輕柔吹吸10次混勻,室溫孵育5分鐘;
[0081]
3.8.3將ep管放置在磁力架上5min至液體澄清,小心吸棄上清,切勿吸到管壁上的磁珠;
[0082]
3.8.4將ep管保持在磁力架上,沿管壁加入200μl 80%乙醇(現配現用) 室溫放置30秒,棄上清,切勿吸到管壁上的磁珠;
[0083]
3.8.5重復上一步用80%乙醇洗一次;
[0084]
3.8.6將ep管保持在磁力架上干燥2-5min,觀察磁珠表面不再反光即可,切勿過度干燥;
[0085]
3.8.7將ep管從磁力架上取下,加入30μl nuclease-free水,輕柔吹打混勻,室溫放置2min,再將ep管放置在磁力架上至液體澄清;
[0086]
3.8.8吸取25μl上清至新pcr管,切勿吸到管壁上的磁珠。
[0087]
3.9qubit定量產物濃度
[0088]
使用qubit dsdna hs assay kit對回收產物定量,具體同步驟3.2。
[0089]
3.10送測序
[0090]
完成上述步驟后,獲得的產物即是測序用的文庫。不同樣品之間等摩爾量混合后,即可進行illumina測序,同一批不同樣品的index組合不能重復,會導致數據無法拆分。
[0091]
本發明的有益效果:
[0092]
本發明引物組合有效解決了既往惡性血液病患者ikzf家族基因突變篩查方法繁瑣、耗時、不規范等問題;臨床一次采血即可達到檢測要求,使用本發明能及時、準確地應用于臨床惡性血液病患者ikzf家族基因突變的檢測,便于對臨床患者預后進行指導。
附圖說明
[0093]
下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0094]
圖1是高通量測序結果質控圖;
[0095]
圖2是高通量測序結果質控圖;
[0096]
圖3是高通量測序結果質控圖;
[0097]
圖4是高通量測序結果質控圖;
[0098]
圖5是高通量測序結果質控圖;
[0099]
圖6是高通量測序結果質控圖;
[0100]
圖7是高通量測序結果質控圖;
[0101]
圖8是高通量測序結果質控圖;
[0102]
圖9是高通量測序結果質控圖。
具體實施方式
[0103]
下面將結合本發明實施例中的附圖,對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例?;诒景l明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例,都屬于本發明保護的范圍。
[0104]
實施例1
[0105]
通過檢測一例臨床患者的樣本來驗證本發明所述方法的特異性、敏感性和精準性。該患者是一例難治性急性髓系白血病m2患者,檢測標本為該患者初診治療前骨髓。
[0106]
具體檢測方法如下:
[0107]
1、采用密度梯度離心法分離得到病人的白血病細胞,使用天津灝洋公司的人外周血淋巴細胞分離液,操作方法見說明書。
[0108]
2、提取核酸:dna的提取建議使用qiagen公司的qiaamp dna blood minikit試劑盒,操作方法見說明書。
[0109]
3、基因突變的檢測方法的操作步驟如下:
[0110]
使用qubit試劑盒定量該患者dna濃度為10.5ng/μl。panel a/b分別加入 dna模板3μl,按照技術方案3.3配制第一步pcr反應體系,運行第一步pcr 反應后進行磁珠純化,選用1.0倍(25μl)agencourt ampure xp磁珠。純化后再次進行qubit試劑盒定量,測得第一步pcr反應產物濃度分別為panel a54.6ng/μl、panel b 50.2ng/μl,分別稀釋至30ng/μl進行第二步pcr反應。選用i5-primer接頭1及i7-primer接頭1,按照技術方案3.6配制第二步
pcr反應體系及運行程序。所得pcr產物選用0.9倍(22.5μl)agencourt ampure xp 磁珠進行純化,qubit定量第二步pcr產物,濃度分別為panel a 27.2ng/μl、 panel b 26.6ng/μl,各取3.68μl、3.76μl進行混合,以上步驟完成后進行高通量測序,測序結果質控見圖1-3,提示測序結果合格。分析測序數據發現該患者存在ikzf1:c.a476g,p.n159s突變,突變頻率為15.4%。
[0111]
4、此實例表明本發明提供的引物組合和方法能夠全面、敏感的檢測惡性血液病患者ikzf家族基因突變,精準檢測出本例急性髓系白血病患者存在ikzf1p.n159s突變,操作可行性和結果可信度高。
[0112]
5、臨床價值:該例患者經標準誘導化療方案治療后未達緩解,再次進行挽救治療方案化療,仍然沒有獲得緩解,確診2個月后死亡,為一例難治性高?;颊?。應用本發明提供的引物組合和方法對該患者治療前骨髓標本進行檢測,發現存在ikzf1 p.n159s突變,與其臨床預后差符合,表明應用本方法可以早期發現高危亞型,有助于盡早進行個體化治療。
[0113]
實施例2
[0114]
通過檢測一例臨床患者的樣本來驗證本發明所述方法的特異性、敏感性和精準性。該患者是一例初發急性淋巴細胞白血病患者。檢測標本為初診治療前骨髓。
[0115]
具體檢測方法如下:
[0116]
1、采用密度梯度離心法分離得到病人的白血病細胞,建議使用天津灝洋公司的人外周血淋巴細胞分離液,操作方法見說明書所述步驟。
[0117]
2、提取核酸:dna的提取建議使用qiagen公司的qiaamp dna blood minikit試劑盒,操作方法見說明書。
[0118]
3、基因突變的檢測方法按以上技術方案中的步驟操作。使用qubit試劑盒定量該患者dna濃度為10.2ng/μl。panel a/b分別加入dna模板3μl,按照技術方案3.3配制第一步pcr反應體系,運行第一步pcr反應后進行磁珠純化,選用1.0倍(25μl)agencourt ampure xp磁珠。純化后再次進行qubit試劑盒定量,測得第一步pcr反應產物濃度分別為panel a 59ng/μl、panel b 56.2ng/ μl,分別稀釋至30ng/μl進行第二步pcr反應。選用i5-primer接頭1及 i7-primer接頭2,按照技術方案3.6配制第二步pcr反應體系及運行程序。所得 pcr產物選用0.9倍(22.5μl)agencourt ampure xp磁珠進行純化,qubit定量第二步pcr產物,濃度分別為panel a 18.9ng/μl、panel b 23.6ng/μl,各取5.29μl、4.24μl進行混合,以上步驟完成后進行高通量測序,測序結果質控見圖4-6,提示測序結果合格。分析測序數據發現該患者存在ikzf2:c.a278g, p.n93s突變,突變頻率為52.6%。
[0119]
4、由此可見本發明提供的引物組合和方法能夠全面、敏感檢測惡性血液病患者ikzf家族基因突變,精準檢測出該例急性淋巴細胞白血病患者存在ikzf2p.n93s突變,操作可行性和結果可信度高。
[0120]
5、臨床價值:該患者為費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病,初診治療前骨髓標本檢測發現ikzf2 p.n93s突變,治療方案選擇靶向治療聯合個體化誘導化療方案,一個療程獲得完全緩解,提示本發明對指導臨床個體化治療具有重要臨床意義和價值。
[0121]
實施例3
[0122]
通過檢測一例臨床患者的樣本進一步驗證本發明所述方法的特異性、敏感性和精準性。該患者是一例初發ph陰性急性淋巴細胞白血病的患者。檢測標本為初診治療前骨髓。
[0123]
具體檢測方法如下:
[0124]
1、采用密度梯度離心法分離得到病人的白血病細胞,建議使用天津灝洋公司的人外周血淋巴細胞分離液,操作方法見說明書所述步驟。
[0125]
2、提取核酸:dna的提取建議使用qiagen公司的qiaamp dna blood minikit試劑盒,操作方法見說明書。
[0126]
3、基因突變的檢測方法按以上技術方案中的步驟操作。使用qubit試劑盒定量該患者dna濃度為1.9ng/μl。panel a/b分別加入dna模板7μl,按照技術方案3.3配制第一步pcr反應體系,運行第一步pcr反應后進行磁珠純化,選用1.0倍(25μl)agencourt ampure xp磁珠。純化后再次進行qubit試劑盒定量,測得第一步pcr反應產物濃度分別為panel a 16.5ng/μl、panel b 13ng/ μl,分別加1.8μl、2.3μl進行第二步pcr反應。選用i5-primer接頭4及 i7-primer接頭7,按照技術方案3.6配制第二步pcr反應體系及運行程序。所得 pcr產物選用0.9倍(22.5μl)agencourt ampure xp磁珠進行純化,qubit定量第二步pcr產物,濃度分別為panel a 13ng/μl、panel b 25.4ng/μl,各取 7.69μl、3.94μl進行混合,以上步驟完成后進行高通量測序,測序結果質控見圖7-9,提示測序結果合格。分析測序數據發現該患者存在ikzf1: c.a476c:p.n159t突變,突變頻率為36.82%。
[0127]
4、此實例顯示本發明提供的引物組合和方法能夠全面、敏感檢測惡性血液病患者ikzf家族基因突變,精準檢測出該急性淋巴細胞白血病患者存在ikzf1p.n159t突變,操作可行性和結果可信度高。
[0128]
5、臨床價值:該患者為費城染色體陰性急性淋巴細胞白血病,鞏固化療階段患者復發,再次誘導化療沒有獲得緩解,患者死亡。應用本發明在該患者治療前骨髓標本中發現ikzf1 p.n159t突變,表明本發明對預后評估和早期發現高危亞型具有臨床指導價值。
[0129]
以上論述和實例表明,本發明提供的方法可以全面、精準、快速檢測各種惡性血液病患者在疾病不同階段是否存在ikzf家族基因(ikzf1-5)突變、精準突變位點和頻數,彌補了現有ikzf基因突變檢測方法的局限性、不完整性,填補了ikzf全部家族基因突變檢測方法的空白,對指導臨床分型診斷、早期篩查高危亞型、預后評估和指導個體化治療,具有重要的臨床實用價值和應用前景。
[0130]
在本說明書的描述中,參考術語“一個實施例”、“示例”、“具體示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0131]
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解,本發明不受上述實施例的限制,上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理,在不脫離本發明精神和范圍的前提下,本發明還會有各種變化和改進,這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。
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