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2-溴棕櫚酸在制備治療生精功能障礙相關疾病的藥物中的應用的制作方法

文檔序號:29648370發布日期:2022-04-13 21:57來源:國知局
2-溴棕櫚酸在制備治療生精功能障礙相關疾病的藥物中的應用的制作方法

1.本發明屬生物醫學類技術領域,具體涉及2-溴棕櫚酸在制備治療生精功能障礙相關疾病的藥物中的應用。


背景技術:

2.不育癥是現代社會中不容忽視的重要醫學問題,在不育夫婦中男性因素占30~50%的比例。生精功能障礙是引起男性不育的主要原因之一。近年來,肥胖率的上升使得脂質代謝紊亂成為導致生精功能障礙的重要病因。飽和脂肪酸的異常增多是脂質代謝紊亂的一大特征,同時也是引發生精功能障礙的一個關鍵因素。因此,針對脂質代謝紊亂及飽和脂肪酸異常增多所致生精功能障礙的治療,已成為近年來亟待解決的醫學問題。
3.精子發生過程是在睪丸生精小管中進行的,受到睪丸微環境中多種細胞的精密調控。在精子發生微環境中,睪丸支持細胞通過形成血睪屏障為精子發生提供免疫豁免的微環境,并保護生精細胞免受外部有害物質的威脅。此外,睪丸間質細胞、管周肌樣細胞和睪丸支持細胞一起通過旁分泌作用對精子發生過程加以調控,以保障精子發生的正常進行。然而,脂質代謝紊亂在精子發生微環境中影響的主要細胞類型及具體作用機制尚不明確,這限制了生精功能障礙相關疾病的醫療范圍。
4.既往研究表明,白藜蘆醇、苯基丁酸鈉鹽、姜黃素、積雪草酸等可部分恢復高脂飲食所致肥胖動物模型的生精功能。此外,褪黑素也被證明可通過緩解飽和脂肪酸所引起的精原干細胞的凋亡、內質網應激及氧化應激等,改善生精功能。然而,在脂質代謝紊亂所致的生精功能障礙中,如何通過改善生精微環境中的細胞功能恢復生精功能,仍知之甚少。在精子發生的睪丸微環境中,睪丸支持細胞作為唯一一類與生精細胞直接接觸的體細胞,不僅形成血睪屏障保護生精細胞免受傷害,通過營養傳輸和旁分泌功能為精子發生提供支持。因此,針對睪丸支持細胞的功能保護的研究將為治療生精功能障礙相關疾病提供新的策略。
5.2-溴棕櫚酸是一種已知的蛋白質棕櫚?;种苿?,通過抑制棕櫚酰轉移酶降低蛋白質棕櫚?;?。根據已有研究,飽和脂肪酸可顯著提高細胞中蛋白質的棕櫚?;?。異常的棕櫚?;筛淖兊鞍踪|的結構和水溶性,進一步影響細胞的狀態及功能,從而引起多種疾病,包括代謝綜合征、癌癥等。作為棕櫚?;种苿?,2-溴棕櫚酸已被證明可緩解炎癥性疼痛、緩解骨癌疼痛、防治骨丟失相關疾病等。但目前未見任何關于2-溴棕櫚酸可改善生精功能的相關用途的報道。


技術實現要素:

6.發明目的:提供一種2-溴棕櫚酸在制備治療生精功能障礙相關疾病的藥物中的應用,能夠為治療生精障礙疾病開拓新方法,為改善生精功能提供新的靶點和思路。
7.技術方案:本發明提供了一種2-溴棕櫚酸在制備治療生精功能障礙相關疾病的藥
物中的應用。
8.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的生精功能障礙相關疾病包括但不限于脂代謝紊亂所致生精功能障礙。
9.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的治療生精功能障礙相關疾病的藥物中包含有2-溴棕櫚酸。
10.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的治療生精功能障礙相關疾病的藥物為改善睪丸支持細胞屏障功能的藥物、提高細胞屏障形成過程中特征基因的藥物或者抑制飽和脂肪酸所致細胞內質網應激的藥物。
11.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的特征基因包括zo-1、occludin、claudin-11以及claudin-5中的一種或多種。
12.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的治療生精功能障礙相關疾病的藥物使用時,2-溴棕櫚酸的給藥劑量為2-40mg/kg。
13.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的治療生精功能障礙相關疾病的藥物的劑型為注射劑、膠囊劑、口服制劑或者微囊制劑。
14.作為本發明應用的進一步限定方案,所述的治療生精功能障礙相關疾病的藥物的給藥方式為口服給藥、非胃腸道給藥、吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、睪丸注射給藥或者通過植入的貯藥裝置給藥中的至少一種。
15.作為本發明應用的進一步限定方案,非胃腸道給藥包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、損傷部位內或者顱內中的至少一種給藥方式。
16.本發明還提供了一種治療生精功能障礙相關疾病的藥物,所述的生精功能障礙相關疾病包括但不限于脂代謝紊亂所致生精功能障礙,所述的藥物中包含有2-溴棕櫚酸。
17.本發明與現有技術相比,其有益效果是:利用跨膜電阻檢測、跨膜熒光滲漏檢測、蛋白質免疫印跡等多種實驗手段,明確了2-溴棕櫚酸可在體外改善睪丸支持細胞在飽和脂肪酸刺激下發生的屏障損傷;通過構建小鼠高飽和脂肪酸生精障礙模型,明確了2-溴棕櫚酸在體內也具有恢復血睪屏障完整性的功能,可顯著改善脂代謝紊亂所致的生精功能障礙;提供了2-溴棕櫚酸治療脂代謝紊亂所致生精功能障礙的體內實驗數據基礎,明確了2-溴棕櫚酸對血睪屏障的保護作用,為生精功能障礙相關疾病提供了新的治療策略。
附圖說明
18.圖1顯示跨膜電阻實驗檢測2-溴棕櫚酸(2-bp)對飽和脂肪酸棕櫚酸(pa)引起睪丸支持細胞屏障損傷的改善作用;
19.圖2顯示跨膜大分子熒光滲漏實驗檢測2-bp對飽和脂肪酸pa引起睪丸支持細胞屏障損傷的改善作用;
20.圖3顯示蛋白質免疫印記檢測2-bp對飽和脂肪酸pa引起緊密連接蛋白表達下降的恢復作用;
21.圖4顯示蛋白質免疫印記檢測2-bp對飽和脂肪酸pa引起內質網應激標記蛋白表達上升的恢復作用;
22.圖5顯示小鼠灌胃2-bp后,飽和脂肪酸pa引起的睪丸總蛋白質過度棕櫚?;伙@著抑制;
23.圖6顯示2-bp恢復了飽和脂肪酸pa誘導的小鼠附睪尾精子數量下降;
24.圖7顯示2-bp恢復了飽和脂肪酸pa誘導的小鼠附睪尾精子活動率下降;
25.圖8顯示體內fitc-i熒光滲漏實驗檢測2-bp恢復了飽和脂肪酸pa誘導的小鼠血睪屏障損傷;
26.圖9顯示電鏡觀察2-bp恢復了飽和脂肪酸pa誘導的小鼠血睪屏障損傷。
具體實施方式
27.下面結合附圖和具體實施例,進一步闡明本發明,應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍,在不背離本發明精神和實質的情況下,對本發明方法、步驟或條件所做的修改或替換,均屬于本發明范圍。
28.若未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段;實施例中所用的試劑為市售商品。
29.實施例1:
30.2-溴棕櫚酸在體外改善睪丸支持細胞在飽和脂肪酸刺激下發生的屏障損傷實例如下。
31.(1)小鼠原代睪丸支持細胞的分離及培養:
32.取20日齡icr雄性小鼠,斷頸處死后用75%消毒酒精浸泡2-5分鐘,于超凈臺內切開下腹部皮膚,取出睪丸,從附睪尾部剪斷精囊取兩側睪丸,放入37℃的pbs的培養皿中,用眼科鑷子撕去脂肪組織、睪丸白膜和血管,暴露出曲細精管,放入另一個呈有pbs的培養皿中。將組織切成小于1mm3的小塊狀,置于5ml d0.25%(m/v)的胰蛋白酶中,37℃震蕩消化4-6分鐘,使生精小管分散。pbs 25-30ml洗滌一遍,去上清。37℃條件下用5ml 0.1%(m/v)的1型膠原酶震蕩消化6-8分鐘,用10%fbs的dmem/f12(v/v,1:1)作為終止液。細胞懸液用100目濾網過濾。pbs 5-10ml洗一遍,4度離心機,1200轉/分鐘,離心6分鐘,去上清,pbs 30ml洗一遍,去上清。將細胞種入培養皿,34℃溫箱(含5%co2)培養,4小時后洗三遍去除生精細胞。第二天換液以再次去除未貼壁的生精細胞。繼續培養直至細胞長至80%密度以上。
33.(2)tm4小鼠睪丸支持細胞系的培養:
34.tm4小鼠睪丸支持細胞系購于賽百慷(上海)生物技術股份有限公司(icell bioscience inc),使用含有5%馬血清和2.5%胎牛血清的dmem/f12作為培養基在37℃、5%co2條件下進行培養。
35.(3)細胞的消化及計數:
36.棄去培養基,pbs清洗細胞兩遍后,胰酶消化1分鐘,顯微鏡下觀察細胞變圓后,加入含有血清的完全培養基終止消化并重懸細胞,室溫下1500rpm水平離心5分鐘,棄上清,加入適量完全培養基重懸細胞,吹打混勻后取20μl滴入血球計數板,顯微鏡下觀察,數出計數板左上、左下、右上、右下及中間共5個中格中的細胞數,每ml細胞數按照“5中格細胞數
×5×
104×
稀釋倍數”進行計算。
37.(4)跨膜電阻實驗檢測細胞屏障完整性:
38.小鼠原代睪丸支持細胞按照0.5
×
106/cm2的密度接種于millicell懸掛細胞小室(pet材質,0.4μm孔徑,merck millipore公司),接種當天記為day1,之后培養3天以形成細胞屏障。屏障形成后,細胞分三組進行處理:pa組加入0.4mm pa,2-bp+pa組加入10μm 2-bp
和0.4mm pa,對照組(control)加入與2-bp+pa組等量的二甲基亞砜溶劑。加藥處理后繼續培養3天。實驗持續期間每天使用millicell電阻檢測系統(merck millipore公司)檢測跨膜電阻。電阻降低表示細胞屏障完整性受損。
39.(5)大分子熒光滲漏實驗檢測細胞屏障完整性:
40.小鼠原代睪丸支持細胞按照0.5
×
106/cm2的密度接種于millicell懸掛細胞小室(pet材質,0.4μm孔徑,merck millipore公司)。待細胞屏障形成后,細胞分三組加藥處理24小時:pa組加入0.4mm pa,2-bp+pa組加入10μm 2-bp和0.4mm pa,對照組(control)加入與2-bp+pa組等量的二甲基亞砜溶劑。熒光滲漏檢測時,在上室加入200μl溶于無酚紅dmem/f12的1mg/ml fitc-dextran,下室加入1.2ml無酚紅dmem/f12。培養箱繼續培養4小時,下室取200μl溶液放入96孔板,使用酶標儀進行熒光量測定(激發光490nm,發射光520nm)。熒光量增多表示細胞屏障完整性受損。
41.(6)蛋白樣本處理及提?。?br/>42.將tm4細胞接種于6孔板中(30
×
104/孔),分為對照組、pa組和2-bp+pa組,pa組加入0.4mm pa,2-bp+pa組加入10μm 2-bp和0.4mm pa,對照組(control)加入與2-bp+pa組等量的二甲基亞砜溶劑。加藥處理24小時后,收集細胞,加入含有蛋白酶抑制劑的ripa細胞裂解液,冰上裂解30分鐘,轉移細胞裂解物至1.5ml離心管,4℃條件下13000rpm離心15分鐘,收集上清至新的1.5ml離心管,bca法測定蛋白濃度,加入1/4體積5
×
蛋白上樣緩沖液,98℃煮5分鐘后,-80℃冰箱保存。
43.(7)蛋白質免疫印跡檢測蛋白表達量:
44.制備好的蛋白樣本,以20μg每樣品上樣至page凝膠,電泳后轉膜至pvdf膜。4℃孵育一抗過夜,tbst緩沖液按照10分鐘每次搖床洗三次。室溫孵育二抗1小時,tbst緩沖液按照10分鐘每次搖床洗三次。使用辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行條帶顯色,并使用化學發光成像系統拍照。用imagej軟件進行條帶的灰度檢測以實現蛋白表達量的量化。
45.結果發現:跨膜電阻檢測實驗(如圖1所示)和大分子熒光滲漏實驗(如圖2所示)均顯示,2-溴棕櫚酸(2-bp)可顯著改善pa引起的睪丸支持細胞屏障損傷。蛋白質免疫熒光檢測顯示,2-bp不僅可提高緊密連接蛋白zo-1、occludin(ocln)、claudin-11(cldn11)和claudin-5(cldn5)的表達量(如圖3所示),亦可降低內質網應激標志性蛋白chop、grp78、atf4和atf6的表達量(如圖4所示)。
46.實施例2:
47.2-溴棕櫚酸在體內可顯著改善脂代謝紊亂所致的生精功能障礙和血睪屏障損傷實例如下。
48.(1)實驗材料選用:
49.動物選用4周齡icr雄鼠;2-bp和pa選用美國sigma公司的。2-bp使用乙醇配制成100mg/ml的儲存液,實驗時用生理鹽水配置成5mg/ml工作液進行注射。pa使用bsa進行螯合,以生理鹽水為溶劑,配制成20mm(約5.13mg/ml)的儲存液(即工作液)。
50.(2)小鼠飼養條件:
51.小鼠在室溫23-27℃、相對濕度40%-70%的環境中飼養,自由飲水和覓食;光照周期為12小時光照-12小時黑暗。小鼠適應性飼養1周后開始實驗。
52.(3)小鼠分組與模型設置:
53.小鼠隨機分為三組:2-bp+pa組每日腹腔注射200mg/kg pa,隔日灌胃40mg/kg 2-bp;pa組每日腹腔注射200mg/kg pa,隔日灌胃與2-bp+pa組等量的含乙醇生理鹽水;對照組(control)每日腹腔注射等體積的bsa溶液(溶于生理鹽水),隔日灌胃與2-bp+pa組等量的含乙醇生理鹽水。實驗時間持續30天。
54.(4)動物取材:
55.小鼠經水合氯醛麻醉后,摘除眼球取血,斷頸處死后取睪丸和附睪。
56.(5)睪丸總蛋白質棕櫚?;綑z測:
57.小鼠睪丸取出后,經液氮速凍,切下1/4用于總蛋白質棕櫚?;瘷z測。該檢測使用?;?生物素置換法。具體操作方法為:使用含有50mm n-乙基馬來酰亞胺的ripa裂解液浸沒組織,將組織剪碎后,進一步超聲破碎。4℃條件下13000rpm離心15分鐘,收集上清至新的1.5ml離心管,4℃旋轉混勻過夜。冰丙酮沉淀蛋白,重懸于4%sds溶液(含4%sds、50mm tris和5mm edta,ph=7.4),每個樣品平均分為2份:一份加等體積1.5m羥胺(ha)溶液,另一份加等體積0.1m tris-hcl溶液(ph=7.4)。室溫旋轉混勻2小時后,冰丙酮沉淀蛋白,用4%sds溶液(含4%sds、50mm tris和5mm edta,ph=6.2)重懸,加入4倍體積的bmcc-biotin溶液(含6.25μm bmcc-biotin、150mm nacl、50mm tris、5mm edta和0.2%triton x-100),室溫旋轉混勻2小時。冰丙酮再次沉淀蛋白,2%sds溶液(含2%sds、50mm tris和5mm edta,ph=7.4,使用前加入蛋白酶抑制劑)重懸溶解蛋白,bca法測定蛋白濃度,加入1/4體積5
×
蛋白上樣緩沖液,98℃煮5分鐘后,-80℃冰箱保存。電泳時,每樣品等體積上樣至page凝膠,電泳后轉膜至pvdf膜,3%bsa室溫封閉2小時,用辣根過氧化物酶結合的鏈霉親和素(hrp-strep)室溫孵育1小時,tbst清洗半小時后,使用辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行條帶顯色,并使用化學發光成像系統拍照。用imagej軟件進行條帶的灰度檢測以實現蛋白表達量的量化。
58.(6)精子懸浮液制備及精子濃度計算:
59.從小鼠中取出的附睪,取附睪尾置于400μl htf溶液中,用注射器針頭輕輕劃撥,使精子從附睪尾游出。收集精子,37℃水浴孵育10分鐘,吹打混勻后,casa檢測精子濃度。
60.(7)精子活動率分析:
61.吸取步驟(6)中制備的精子懸浮液,滴于載玻片上,蓋上蓋玻片,casa檢測精子活動率。
62.(8)體內fitc-i熒光滲漏實驗檢測血睪屏障完整性:
63.在處死小鼠前2小時,新鮮配置5mg/ml的fitc-i溶液(溶于pbs),每只小鼠尾靜脈注射200μl。解剖小鼠時,取單側睪丸制備冷凍切片。熒光顯微鏡觀察睪丸中fitc-i熒光滲漏入生精小管的情況。生精小管中出現熒光表示血睪屏障完整性受損。
64.(9)電鏡觀察緊密連接:
65.取小鼠睪丸組織,切出1mm3大小的組織塊,浸于含有2.5%戊二醛的0.1m磷酸鹽緩沖液進行固定,依次使用1%四氧化鋨、2%乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行染色。切片后使用透射電子顯微鏡進行觀察。正常的緊密連接結構緊實且連續,緊密連接受損后該結構會變得松散、斷裂。
66.結果發現:2-溴棕櫚酸(2-bp)可有效降低pa注射引起的小鼠睪丸內蛋白質棕櫚?;疆惓I?如圖5所示)。對于pa引起的生精障礙,2-bp有顯著的治療效果,不僅提高
了精子濃度(如圖6所示),而且增加了精子活動率(如圖7所示)。體內fitc-i熒光滲漏實驗(如圖8所示)和電鏡觀察(如圖9所示)結果也顯示,2-bp具有恢復血睪屏障完整性的功能。
67.如上所述,盡管參照特定的優選實施例已經表示和表述了本發明,但其不得解釋為對本發明自身的限制。在不脫離所附權利要求定義的本發明的精神和范圍前提下,可對其在形式上和細節上作出各種變化。
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